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高效液相色譜法按分離機制同分液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法
1．液固色譜法 使用固體吸附劑被分離組分色譜柱上分離原理根據(jù)固定相對組分吸附力大小同而分離分離過程吸附－解吸附平衡過程常用吸附劑硅膠或氧化鋁粒度5~10μm適用于分離分子量200~1000組分大多數(shù)用于非離子型化合物離子型化合物易產(chǎn)生拖尾常用于分離同分異構(gòu)體
2．液液色譜法 使用特定液態(tài)物質(zhì)涂于擔體表面或化學鍵合于擔體表面而形成固定相分離原理根據(jù)被分離組分流動相和固定相溶解度同而分離分離過程分配平衡過程
涂布式固定相應具有良好惰性；流動相必須預先用固定相飽和減少固定相從擔體表面流失；溫度變化和同批號流動相區(qū)別常引起柱子變化；另外流動相存固定相也使樣品分離和收集復雜化由于涂布式固定相難避免固定液流失現(xiàn)已少采用現(xiàn)多采用化學鍵合固定相C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱
液液色譜法按固定相和流動相極性同分正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)
正相色譜法 采用極性固定相（聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相相對非極性疏水性溶劑（烷烴類正已烷、環(huán)已烷）常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等調(diào)節(jié)組分保留時間常用于分離等極性和極性較強化合物（酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）
反相色譜法 般用非極性固定相（C18、C8）；流動相水或緩沖液常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶有機溶劑調(diào)節(jié)保留時間適用于分離非極性和極性較弱化合物RPC現(xiàn)代液相色譜應用廣泛據(jù)統(tǒng)計占整HPLC應用80%左右
隨著柱填料快速發(fā)展反相色譜法應用范圍逐漸擴大現(xiàn)已應用于某些無機樣品或易解離樣品分析控制樣品分析過程解離常用緩沖液控制流動相pH值需要注意C18和C8使用pH值通常2.5~7.5（2~8）太高pH值會使硅膠溶解太低pH值會使鍵合烷基脫落有報告新商品柱pH 1.5~10范圍操作
正相色譜法與反相色譜法比較表
正相色譜法 反相色譜法
固定相極性 高～ ～低
流動相極性 低～ ～高
組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出
從上表看出當極性等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯界線（氨基鍵合固定相）
3．離子交換色譜法 固定相離子交換樹脂常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成聚合物骨架表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）被分離組分色譜柱上分離原理樹脂上電離離子與流動相具有相同電荷離子及被測組分離子進行逆交換根據(jù)各離子與離子交換基團具有同電荷吸引力而分離
緩沖液常用作離子交換色譜流動相被分離組分離子交換柱保留時間除跟組分離子與樹脂上離子交換基團作用強弱有關外還受流動相pH值和離子強度影響pH值改變化合物解離程度進而影響其與固定相作用流動相鹽濃度大則離子強度高利于樣品解離導致樣品較快流出
離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸
4．離子對色譜法 又稱偶離子色譜法液液色譜法分支根據(jù)被測組分離子與離子對試劑離子形成性離子對化合物非極性固定相溶解度增大從而使其分離效改善主要用于分析離子強度大酸堿物質(zhì)
分析堿性物質(zhì)常用離子對試劑烷基磺酸鹽戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等另外高氯酸、三氟乙酸也與多種堿性樣品形成強離子對
分析酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽
離子對色譜法常用ODS柱（即C18）流動相甲醇-水或乙腈-水水加入3~10 mmol/L離子對試劑定pH值范圍內(nèi)進行分離被測組分保時間與離子對性質(zhì)、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關
5．排阻色譜法 固定相有定孔徑多孔性填料流動相溶解樣品溶劑小分子量化合物進入孔滯留時間長；大分子量化合物能進入孔直接隨流動相流出利用分子篩對分子量大小同各組分排阻能力差異而完成分離常用于分離高分子化合物組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等
色譜法基本原理
利用樣品混合物各組分理、化性質(zhì)差異各組分程度同分配互相溶兩相當兩相相對運動時各組分兩相反復多次重新分配結(jié)使混合物得分離
兩相固定動相稱固定相；移動相稱流動相
分類：
根據(jù)流動相分—氣體作流動相—氣相色譜——固定相液體 氣-液色譜
固定相固體 氣-固色譜
—液體作流動相—液相色譜——固定相液體 液-液色譜
固定相固體 液-固色譜
—當流動相接近臨界溫度和壓力下工作液體時——超臨界色譜
根據(jù)固定相附著方式
—固定相裝圓柱管—柱色譜
—固定相涂敷玻璃或金屬板上—薄膜色譜（平板色譜）
—液體固定相涂紙上—紙色譜（平板色譜）
根據(jù)分離機理
—分配色譜—樣品組分分配系數(shù)同
—吸附色譜— 樣品組分對固定相表面吸附力同
—體積排阻色譜—利用固定相孔徑同把樣品組分按分子大小分開
—離子交換色譜—同離子與固定相商相反電荷間作用力大小同
根據(jù)極性
—流動相極性＞固定相極性-反相色譜
—流動相極性＜固定相極性-正相色譜
氣相色譜只適合分析較易揮發(fā)、且化學性質(zhì)穩(wěn)定有機化合物而HPLC則適合于分析些用氣相色譜難分析物質(zhì)揮發(fā)性差、極性強、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差物質(zhì)所HPLC應用范圍已經(jīng)遠遠超過氣相色譜

、吸附色譜（adsorption chromatography）
又叫液固色譜法：流動相液體固定相固體
分離原理：固定相固體吸附劑吸附劑多孔性微粒物質(zhì)表面有吸附心樣品組分與流動相競爭吸附 心各組分吸附能力同使組分固定相產(chǎn)生保留時間同和實現(xiàn)分離
固定相： 固定相通常強極性硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固體吸附劑活性硅膠常用
流動相： 弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑混合物正構(gòu)烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲 烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等
應用： 對于極性結(jié)構(gòu)異構(gòu)體分離和族分離仍有效方法農(nóng)藥異構(gòu)體分離、石油烷、烯、芳烴 分離 缺點容易產(chǎn)生對稱峰和拖尾現(xiàn)象
二、分配色譜
原理： 固定液機械吸附惰性載體上樣品分子依據(jù)們流動相和固定相間溶解度同分別進入兩相分配而實現(xiàn)分離
固定相：種極性或非極性固定液吸附惰性固相載體上全多孔微粒硅膠吸附劑
根據(jù)極性同分類：正相分配色譜—固定相載體上涂布極性固定液；
流動相非極性溶劑；
分立極性較強水溶性樣品；
弱極性組分先洗脫出來
反相分配色譜—固定相載體上涂布非極性或弱極性固定液；
流動相極性溶劑；
強極性組分先洗脫出來
液-液分配色譜固定相固定液體往往容易溶解流動相去所重現(xiàn)性差且能進行梯度洗脫已經(jīng)大人們所采用
三、鍵合相色譜
考慮分配色譜法固定液缺點因此各種同有機關能團通過化學反應共價結(jié)合固定相惰性載體上固定相會溶解流動相去了
鍵合固定相優(yōu)點：○ 對極性有機溶劑有良好化學穩(wěn)定性
○使色譜柱柱效高、壽命長
○實驗重現(xiàn)性好
○幾乎適于各種類相有機化合物分離尤其k’寬范圍樣品
○梯度洗脫
根據(jù)極性同分類：正相鍵合相色譜—固定相極性＞流動相極性
固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團有機分子
適于分離脂榮、水溶性極性、強極性化合物
反相鍵合相色譜—固定相極性＜流動相極性
固定相：烷基、苯基等非極性有機分子常用ODS柱或C18柱 典型代表其極性小
適于分離非機性、弱極性離子型樣品
當今液相色譜主要分離模式
正相HPLC（normal phase HPLC）：
由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成HPLC體系其代表性固定相改性硅膠、氰基柱等代表性流動相正己烷吸附色譜也屬正相HPLC
反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非極性固定相和極性流動相所組成液相色譜體系與正相HPLC體系正好相反其代表性固定相十八烷基鍵合硅膠(ODS柱Octa Decyltrichloro Silane)代表性流動相甲醇和乙腈
四、體積排阻色譜（SECsize exclusion chromatograghy）
（又稱凝膠色譜和分子篩色譜）
原理： 多孔凝膠（葡萄糖瓊脂糖硅膠聚丙烯酰胺等）作固定相依據(jù)樣品分子量大小達分離目 大分子進入凝膠孔洞沿多孔凝膠膠粒間隙流出先被洗脫；小分子進入大部分凝膠孔洞 柱被強滯留被洗脫
根據(jù)樣品性質(zhì)分類：凝膠過濾（GFC）—用于分析水溶性樣品多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核 苷酸、多糖
凝膠滲透（GPC）—用于分析脂溶性樣品測定高聚物分子量
SEC主要依據(jù)分子量大小進行分離因此與樣品、流動相間相互作用無關因此采用改變流動相組成來改善分離度
五、離子交換色譜
（ion exchange chromatography, IEC）
分離原理：使用表面有離子交換基團離子交換劑作固定相帶負電荷交換基團（磺酸基和羧酸基）用于陽離子分離；帶正電荷交換基團（季胺鹽）用于陰離子分離同離子與交換基作用力大小同樹脂保留時間長短同從而被相互分離